脑室管膜上皮细胞，也称为E1细胞，富含运动纤毛1通过纤毛摆动产生定向脑脊液流2,3和维持大脑内稳态3-5。纤毛运动缺陷会引起脑脊液流的异常，从而导致脑积水1-3,6。为了能产生定向脑脊液流，E1细胞必须协调每个细胞和邻近细胞间的纤毛摆动3。近年来，该领域内提出了一种全组织技术(Wholemounttechnique)，用于研究脑室产生的脑脊液流2,3,7。该方法将整个组织块（含纤毛面朝上）放置在活体皿中，随后在组织块表面添加荧光微球，追踪荧光微球的轨迹，以模拟脑脊液的流动。然而，在许多实验室中，同时追踪荧光微球的流动和对应的纤毛摆动是很困难的，因为现在很多实验平台进行实时成像大多是用倒置显微镜，也就是说，含纤毛面朝下（非朝上）倒置在活体皿底部。
在此，我们基于先前技术2,3,7描述了一种改进方法：室管膜组织解剖和活体组织振动切片技术，用来检测荧光微球的流动和微球下一大片E1细胞的纤毛摆动。用这种方法，需要在振动切片机上切新鲜的室管膜组织，得到μm厚度的活体切片。这样的厚度可以保证切片在成像过程中始终漂浮，以防切片沉降到活体皿底，导致纤毛被压着不动。荧光微球(直径为nm)悬浮在培养液中，当扩散至切片的纤毛区域时可以检测到微球流动以示液体流；用SiR-tubulin(nM)标记纤毛，以检测纤毛摆动。我们应用该方法研究了纤毛基因敲除小鼠E1细胞的纤毛摆动和对应的液体流动。此外，新鲜切下的室管膜切片也可用于免疫荧光染色。
摘要模式图
一、材料与试剂
动物：
4周龄野生型小鼠，小鼠遗传背景为C57/BL6。
试剂和耗材：
0.22μm过滤器(Millipore,SLGPR33RB)50mL离心管(Falcon,)35mm玻璃底活体皿(Cellvis,D35-20-1.5-N)10cm活体皿(Ctrueblue,CT)超纯水培养液(ThermoFisherScientific,GibcoTM,)，4°C储存显微镜镜油(Leciamicrosystem,)解剖缓冲液(详见试剂配方补充)，4°C储存组织切片培养液(详见试剂配方补充)，储存SiR-tubulin(Spirochrome,SC)荧光微球(nm直径)(Invitrogen,F)双面刀面(FlyingEagle,74-C)纯狼毫勾线笔(Marie,GA)试剂配方补充
a.解剖液，pH7.4：
用0.22μm过滤器过滤后,4°C储存。
b.组织切片培养液：
二、仪器软件
超纯水制备系统(Millipore,model:AdvantageA10)
锋利镊子(Dumont,-5/45-PO)
镊子(Dumont,-5/15-PO)
配备DP72相机的宽场体视镜(Olympus,SZX16)
振动切片机(Leica,LeicaVT0S)
配备63×/1.4油浸物镜共聚焦显微镜(Leica,TCSSP8WLLsystem)
配备HamamatsuORCA-Fusion相机的转盘共聚焦超分辨率显微镜(Olympus,IX83P2ZF)
显微镜自带操作系统以及Fiji软件
三、实验操作
小鼠脑室管膜上皮的纤毛运动与液体流的实时成像
该作品在Bio-protocol第三届生物实验短视频大赛中荣获二等奖，欢迎访问网站查看原视频:
